Nei legami chimici gli elettroni appaiati hanno spin opposto, i loro momenti magnetici sono, quindi, opposti e i loro effetti si annullano. Per questo motivo sostanze chimiche che contengono un numero di elettroni pari hanno momenti magnetici elettronici netti nulli. Ci sono tuttavia un certo numero di sostanze che contengono elettroni dispari. Queste sono:
1) radicali liberi: hanno un solo elettrone libero
2) bi-radicali: hanno due elettroni dispari sufficientemente distanti l’uno dall’altro in modo che le
interazioni reciproche siano deboli
3) entità stato-tripletta: hanno due elettroni dispari fortemente accoppiati
4) entità con tre o più elettroni dispari
5) imperfezioni localizzate nel cristallo
6) ioni dei metalli di transizione e ioni delle terre rare
Nei sistemi biologici si trovano maggiormente sostanze del primo ed ultimo gruppo; di particolare interesse sono i radicali liberi, che si producono durante certe reazioni enzimatiche tipiche dei processi metabolici. La presenza di radicali liberi (caratterizzati da un’elevata reattività chimica) in un tessuto è indice di un danno al tessuto stesso. Normalmente la loro vita media è molto breve, perché l’organismo è in grado di distruggerli. Se, però, sono presenti nel tessuto dei radicali liberi, e questo lo si rileva mediante l’ESR, allora vuol dire che l’organismo ha "abbassato le difese". Questo accade in vari processi patologici come l’invecchiamento o la carcinogenesi .
Dunque nel caso di sostanze quali i radicali liberi si ha un elettrone dispari; l’intera molecola, quindi, ha un momento magnetico di spin elettronico risultante non nullo. Come detto precedentemente, per effetto di un campo magnetico statico esterno applicato H0, il dipolo magnetico associato a tale molecola, si allinea nella direzione del campo assumendo due possibili orientazioni: parallela, corrispondente a uno stato stabile di minima energia (E-), e antiparallela, associata ad uno stato instabile di massima energia (E+). Il gap di energia DE è tale da soddisfare la (12). Con l’applicazione di H0 si è creato, così, all’interno del tessuto, un sistema risonante. Se, infatti, si invia un campo a radiofrequenza,
proprio alla frequenza f = DE/h, i dipoli magnetici paralleli potranno assorbire dalla radiazione applicata un quanto di energia DE per saltare ad uno stato energetico superiore, mentre i dipoli magnetici antiparalleli emetteranno un quanto di energia DE per tornare ad uno stato energetico inferiore. Si definisce condizione di risonanza la seguente:
A tale condizione deve soddisfare il campo elettromagnetico variabile applicato affinchè si abbia scambio di energia fra il campo stesso e il sistema e, quindi, si abbia assorbimento o emissione indotta da parte dello stesso sistema. Le particelle distribuite termicamente lungo livelli di energia quantizzata occupano sempre gli stati più stabili, allora, in condizioni di risonanza, i dipoli magnetici saranno in maggioranza paralleli. Il fenomeno di risonanza, dunque, darà origine ad un netto assorbimento di energia da parte del sistema. Tale assorbimento netto di energia, in condizioni di risonanza, è stato scoperto ed amplificato per fornire il segnale ESR.
Analizziamo il fenomeno dell’assorbimento, descritto sopra secondo una visione quantistica, dal punto di vista dielettrico. E’ noto che per la costante dielettrica comlessa e si ha l’espressione:
e = e’ - j e’’ (18)
In presenza di un campo elettrico il termine e’’dà ragione dell’assorbimento di potenza, perché ad esso è associata la conducibilità del materiale. Il contributo alla conducibilità del materiale è dato da due termini: uno statico e l’altro dinamico. Il primo è legato alla conducibilità intrinseca del materiale, che sotto l’azione di un campo elettromagnetico produce flusso di ioni nella direzione del campo. Il secondo, invece, è associato a fenomeni di oscillazione e rilassamento dei dipoli elettrici indotti dal campo elettrico applicato (che produce una deformazione della molecola) o già presenti nel materiale
(come nel caso di tessuti contenenti acqua). In modo duale si potrebbe pensare di scomporre la costante di permeabilità come:
µ = µ’- jµ’’ (19)
dove la µ’’, come la e’’, dà ragione delle perdite per assorbimento del materiale quando questo è sottoposto, però, all’azione di un campo magnetico variabile a frequenza opportuna (quella di risonanza). In condizioni normali i materiali biologici hanno µ’’= 0 e, quindi, non ci sono perdite associate alla permeabilità. La presenza di un campo magnetico statico crea, tuttavia, come visto, un sistema risonante in grado di assorbire energia grazie alle vibrazioni indotte sul reticolo quando su di esso è applicato un campo a RF di frequenza opportuna.
Si è detto che per misurare il segnale ESR è necessario avere un assorbimento netto di energia da parte del sistema biologico, quando questo è accoppiato con un campo magnetico statico H0 applicato in condizioni di risonanza.
E’ noto che, in base alla statistica di Boltzamann, il rapporto tra la probabilità N+ di trovare un momento magnetico a livello di energia superiore E+ e quella N- di trovarlo a livello inferiore E- è data da:
dato che E+ -E- = DE = gßH0 è di tre ordini di grandezza inferiore a kT l’esponenziale diventa:
1 - ---------- = 1- ------
(21) dove f è la frequenza di risonanza del sistema.
Se il rapporto N+/N- fosse prossimo ad 1 i due livelli di energia sarebbero equipopolati e la radiazione emessa sarebbe uguale a quella assorbita. In tale situazione non si potrebbe misurare un assorbimento netto di energia e, quindi, il segnale ESR. E’, invece, opportuno avere un rapporto N+/N- inferiore ad 1, in questo modo è maggiore la probabilità di avere una transizione al livello E+ rispetto alla probabilità di avere una transizione al livello E-. Per avere N+/ N- inferiore ad 1 è necessario aumentare la frequenza. Se, infatti, si considera una temperatura di 300K e una frequenza dell’ordine dei Mhz (RF) il rapporto N+/N- risulta prossimo ad 1, mentre crescendo in frequenza, a parità di
temperatura, diventa minore di 1. Si spiega, così, perchè sia necessario far risuonare il sistema alle microonde. Nella spettroscopia ESR si usa in particolare la frequenza di risonanza di 9.5 Ghz.
Lavorare a frequenze così alte implica, però, usare forti campi magnetici statici. Infatti, come detto, vale la seguente relazione:
gßH0 = hf (22)
da qui si vede che, a parità di g, ß e h, frequenze elevate comportano campi statici molto forti.
Il circuito a microonde che rappresenta uno spettrometro ESR è dato in fig.28. Si riconosce la presenza di un circolatore, componente a microonde non reciproco, utilizzato soprattutto nei sistemi radar, che permette la propagazione della radiazione nel verso indicato dalle frecce. La radiazione inviata dalla sorgente va alla cavità risonante e da qui è eventualmente riflessa verso il rivelatore collegato ad un display,che permette di visualizzare il segnale riflesso. Il sistema di rivelazione è costituito da un diodo a cristallo di silicio o da un dispositivo a semiconduttore detto "batch diode". Tali oggetti fungono da rettificatori a microonde in quanto convertono un segnale a microonde in una corrente continua Id.
Scopo della spettrometria ESR è, come detto all’inizio, di rilevare la concentrazione di certe molecole all’interno dei tessuti. Per fare questo si mette nella cavità il tessuto, al quale è applicato un campo statico in modo da creare un sistema risonante, si invia, poi, una radiazione elettromagnetica alle microonde, il segnale riflesso è proporzionale alla concentrazione della sostanza di interesse.
Si potrebbe pensare di fissare il campo magnetico statico H0 e di variare la frequenza di emissione della sorgente. Il tessuto biologico all’interno della cavità assorbe un quanto di energia DE soltanto quando la sorgente emette alla frequenza di risonanza f = gßH0/h e in queste condizioni sul display si rileva un picco proprio a quella frequenza. Al variare della frequenza nell’intorno di f = DE/h si ha una riflessione verso il rivelatore e quindi si avrà una certa dispersione del segnale nell’intorno della frequenza di risonanza . Si vedrà in seguito per quali altri motivi non è possibile ottenere una semplice riga nello spettro ESR.
In realtà si utilizza lo spettrometro ESR in altro modo: si accorda preventivamente la sorgente alla cavità risonante attraverso un sistema a controreazione, che permette un controllo automatico della frequenza, e si va a variare, attraverso un elettromagnete il campo statico H0, applicato sul tessuto in esame. In queste condizioni si ha totale assorbimento, rilevato sempre con un picco sul display, soltanto quando l’intensità del campo magnetico statico soddisfa alla relazione :
H0 = fh/(gß).
Per analizzare più in dettaglio la sorgente di uno spettrometro ESR si considera lo schema di fig. 29.
La sorgente è un klystron la cui uscita è un segnale nel range delle microonde, cosa che, come visto, è necessaria per avere lo spettro ESR. Tale sorgente è dotata di alta stabilità perchè può essere sintonizzata ad una certa frequenza di lavoro (9.5GHz nel caso in questione) sia meccanicamente che elettronicamente. L’alimentatore serve per far funzionare il klystron stesso. Il blocco sorgente si compone, poi, di due componenti a microonde: un isolatore e un attenuatore. L’isolatore garantisce l’unidirezionalità del flusso di potenza; cioè grazie ad esso la potenza emessa dal klystron va tutta verso il circolatore. L’attenuatore permette di controllare il livello di potenza inviata dal generatore al tessuto biologico. Il detector, che fa parte del blocco di rivelazione dello schema di fig. 28, permette di realizzare anche il controllo automatico di frequenza (CAF).
E’ necessario, come detto precedentemente, accordare preventivamente il klystron e la cavità risonante. Volendo lavorare alla frequenza dirisonanza di 9.5 GHz, si dovrà, quindi:
1) fare in modo che il klystron emetta sempre a quella frequenza
2) progettare opportunamente la cavità risonante
Analizziamo il primo problema. Noto che vale la f = DE/h allora, immaginando di avere a disposizione la cavità risonante vuota che lavora alla frequenza di risonanza di 9.5GHz, si invia una radiazione di energia DE verso la cavità. Se la frequenza di emissione è uguale a quella di risonanza della cavità non si ha potenza riflessa, perché la cavità e il klystron lavorano alla stessa frequenza. Il CAF, quindi, non interviene. Se, però, la frequenza di emissione è diversa da 9.5GHz allora il detector rileva il segnale riflesso e, così, si innesca il meccanismo di controreazione che riporta il klystron alla frequenza di lavoro desiderata.
Relativamente al problema di progetto della cavità risonante si devono rispettare la seguenti specifiche:
1) La cavità deve risuonare alla frequenza di 9.5GHz
2) Il tessuto biologico, inserito nella cavità, deve subire solo perdite di tipo magnetico; è, quindi,
opportuno creare una zona della cavità dove il campo elettrico sia nullo, mentre il campo magnetico
sia massimo.
Nello spettrometro ESR si utilizza, quale cavità risonante, quella ottenuta da una guida d’onda rettangolare, di dimensioni trasverse a e b e chiusa a quota z = 0 e z = l su piatti metallici , fig.30. Volendo soddisfare le specifiche dette è necessario imporre che il risonatore oscilli sul modo TE102 . Sappiamo, infatti, che il modo TE10 è il fondamentale per una guida d’onda rettangolare ed ha componenti trasverse con linee di forza date in fig.31.
Il modo TE102 garantisce, in particolare, il verificarsi della seconda specifica. Fissato, infatti, l = l e noto, dalla teoria delle guide d’onda, che per la cavità risonante le componenti di campo sono nel caso particolare:
Ey = et 2jP1sen(2pz /l)
Hx = -htP12cos(2pz/l)
Allora Ey è nullo se z = l /2, mentre è massimo se z = l /4 e z = 3 l /4, al contrario Hx è massimo se z = l/2 ed è nullo se z =l / 2 e z = 3 l /4. E’, così, giustificato l’ andamento delle linee di forza dato in fig.32.
Si è, così, individuata nel centro della cavità risonante la zona dove è opportuno mettere il tessuto biologico.
Le dimensioni a, b, e l della cavità risonante dovranno essere fissate in modo tale che assegnate w0 = 9.5GHz, m = 1, n = 0 e s = 2 (indici caratteristici del TE102) sia soddisfatta la:
w0 = (1 / (µe )1/2) (( mp/a)2 + (np/b)2 + (sp/l)2)1/2
Nel progettare tale circuito è necessario, inoltre, assicurarsi che la cavità sia adattata alla linea di alimentazione in modo da garantire il massimo trasferimento di potenza dal generatore alla cavità. E’ noto che il circuito equivalente, per una cavità risonante, è del tipo RLC serie, fig. 33. L’adattamento è realizzato imponendo che la resistenza Rr sia uguale alla impedenza caratteristica della linea n.
In condizioni di risonanza L e C sono cortocircuitati ( w02 = 1/LC ), quindi, il circuito si riduce alla sola resistenza Rr. Con il soddisfacimento delle specifiche il segnale emesso dal klystron a 9.5GHz, se la cavità è adattata e sintonizzata, viene totalmente assorbito; non si ha,quindi, segnale riflesso sul detector; in queste condizioni la corrente Id è nulla.
Lo spettrometro ESR, come detto, è usato facendo variare il campo statico H0, a cui il tessuto è esposto, in modo da sintonizzare il sistema biologico con la radiazione emessa dal klystron: H0 = (h/gß)f. Il campo magnetico statico viene applicato mediante un elettromagnete che può generare campi fino a 3400G. L’elettromagnete è disposto come in fig.34. Si tratta, in pratica, di una bobina avvolta alla cavità risonante nel verso della lunghezza e in grado di generare un campo magnetico statico ortogonale al campo emesso a RF dal klystron.
Per mantenere il più possibile uniforme il campo H0 applicato (sono tollerate variazioni di questo di 100 mGauss) è predisposta una sonda, in grado di misurare il campo e di agire sul sistema di alimentazione attraverso un meccanismo di controreazione.
Ricordando che la cavità risonante è sintonizzata alla frequenza di emissione del klystron ( f = 9.5GHZ) ed è adattata alla linea di alimentazione, si vedrà, ora, cosa succede al variare di H0 quando si inserisca il tessuto nella cavità. Il circuito equivalente, in questo caso, si riduce a quello di fig.35,dove la resistenza variabile Rm rappresenta il tessuto biologico.
Se il campo statico è tale da non soddisfare la H0 = (h/gß)f, allora, il sistema complessivo non vede il tessuto biologico. Il circuito è ancora costituito dalla sola resistenza Rr. In queste condizioni la cavità è sempre adattata alla linea e assorbe tutta la potenza emessa dal klystron. La corrente Id rilevata dal detector è, quindi, nulla.
Se, invece, H0 soddisfa la relazione detta allora il tessuto biologico, che è un oggetto risonante, si sintonizza con il resto del sistema. In questo caso il circuito equivalente è costituito dalla serie Rr e Rm ed è disadattato alla linea di alimentazione. Il segnale a RF emesso è, così, in parte assorbito e in parte riflesso; la componente riflessa è visualizzata sul detector (in particolare utilizzando una cavità a riflessione) come un picco nella corrente Id.
La curva di assorbimento, che costituisce lo spettro ESR, mostra la variazione della corrente rilevata dal detector, legata al segnale riflesso, in funzione di H0. La curva non è una riga centrata in H0 = (h/gß)f, ma mostra una certa dispersione attorno al valore centrale (fig.36 ). Il picco della curva è legato all’entità della radiazione riflessa che è tanto maggiore quanto più grande è la capacità di assorbimento del tessuto biologico. Quest’ultima è legata, a sua volta, alla concentrazione di molecole paramagnetiche (es: i radicali liberi) all’interno del tessuto stesso. Si conclude che il picco di corrente misura la concentrazione di sostanze paramagnetiche nel tessuto. Nella pratica, per eliminare il rumore di ricezione, in luogo della curva di assorbimento detta si usa la sua derivata, fig. 37.
Lo spettro ESR può essere utilizzato, inoltre, per riconoscere il tipo di sostanze paramagnetiche presenti nel tessuto. Al variare del "fattore g", caratteristico di ogni sostanza, cambia, fissata la frequenza, la posizione del picco della curva di assorbimento, cosa che consente di riconoscere i diversi materiali.
L’allargamento delle linee nello spettro ESR è dovuto a due processi fondamentali: il secular broadening e il lifetime broadening .
Il secular broadening è un processo di dispersione causato da una variazione locale, temporale o spaziale, del campo megnetico. Nel primo caso ogni dipolo è sottoposto a un campo magnetico locale che fluttua nel tempo, mentre nel secondo il campo magnetico varia da un centro paramagnetico all’altro, ma resta costante nel tempo. In entrambi i casi l’assorbimento della radiazione emessa, ad una frequenza assegnata, avviene in corrispondenza a valori diversi di H0 (tali da soddisfare la hf = g ßH0), centrati intorno ad un valore significativo a cui corrisponde il massimo della Id.
Il lifetime broadening è un fenomeno di allargamento puramente quantistico. Si è visto che le molecole si orientano sotto la azione del campo statico, creando un gap DE nello stato energetico del sistema biologico. Il tempo Dt in cui ciascun dipolo magnetico si mantiene orientato nella direzione del campo, in modo parallelo o antiparallelo, è finito e diverso per i vari centri paramagnetici; dunque, anche il gap
DE è finito e variabile da un centro paramagnetico all’altro, dovendo essere soddisfatto il principio di indeterminazione di Heisemberg : DEDt = h/2p.
Ancora una volta, quindi, l’assorbimento avviene in un range DH di valori di campo statici.
A causa dell’interazione, tra uno spin elettronico e quelli circostanti, prodotta dal moto casuale delle molecole, sono possibili transizioni del sistema biologico da uno stato energetico all’altro anche in assenza di stimoli esterni. Il tempo T1 di permanenza del sistema in uno stato, a seguito di una transizione naturale, è finito e tale da produrre una linea, di una certa ampiezza, nello spettro quando si invii una radiazione a RF che verifichi la condizione di risonanza. Questo tempo T1 è il tempo di rilassamento spin-reticolo e fornisce una misura dell’efficienza del contatto termico tra sistema di spin e reticolo stesso. Dato che l’interazione fra gli spin elettronici dipende dall’agitazione termica, il tempo T1 varia con la temperatura, in particolare diminuisce all’aumentare di questa.
Se si impone un campo a microonde, tale da soddisfare la solita relazione di risonanza, si ha una cessione di energia DE al sistema secondo la teoria dell’assorbimento.
Indicata con K2 la quantità di energia ceduta al sistema, proporzionale alla potenza a microonde inviata e alla frequenza di risonanza e, quindi, proporzionale all’inverso di un tempo ( in particolare proporzionale all’inverso del periodo del segnale a microonde applicato) e con K1 l’inverso del tempo di rilassamento, si possono distinguere due casi:
1) K2 << K1 : il tempo di rilassamento è più piccolo del tempo di variazione del segnale a microonde
applicato. In questa situazione è possibile lo scambio di energia fra il sistema di spin e il reticolo.
2) K2 = K1 : i tempi di rilassamento e di variazione del segnale sono confrontabili. In questo caso lo
scambio di energia non può avvenire, in quanto la radiazione applicata non vede il gap energetico.
Questo fenomeno è noto come saturazione e pone un limite alla potenza della radiazione a microonde, legata come detto a K2.
Si è visto che il tessuto va inserito nel centro della cavità dove il campo elettrico è nullo. Il posizionamento del tessuto nella zona centrale della cavità non è sempre possibile, date ad esempio le
dimensioni finite di esso. Per questo motivo, quindi, si ha, in generale, anche un assorbimento legato all’azione del campo elettrico con conseguente distorsione dei risultati spettroscopici. Se, inoltre, il tessuto è ad alto contenuto di acqua l’entità dell’assorbimento è significativa. L’acqua, infatti, alla frequenza di 9.5GHz mostra un fenomeno di rilassamento rotazionale: a causa della sua natura dipolare la molecola H2O oscilla sotto l’azione del campo elettrico. Per ovviare a questo inconveniente, non potendo abbassare la frequenza di risonanza per i motivi visti, si congela il tessuto in azoto liquido. In questo modo la permittività dell’acqua passa da 80 a 2 si riduce, così, la conducibilità equivalente e, quindi, l’assorbimento a microonde. Per questa ragione la tecnica ESR si applica bene su campioni congelati in azoto liquido.
Per estendere lo studio anche a materiali privi di molecole paramagnetiche si usano dei probe magnetici dotati di momenti intrinseci: gli spin label .Questi vengono inseriti all’interno di un sistema biologico in condizioni non patologiche e si misura lo spettro di risonanza elettronica. Se si ripete lo stesso esperimento con il medesimo sistema biologico e lo stesso probe magnetico, ma in condizioni patologiche, è possibile trovare delle variazioni nei parametri caratteristici della risonanza che possono dare informazioni sulla esistenza ed, eventualmente, sulla dinamica di questi stati patologici.
L’ESR è un metodo diagnostico integrativo e in alcuni casi sostitutivo delle radiazioni ionizzanti nelle seguenti situazioni:
1) diagnosi di leucemia
2) diagnosi di tumori solidi
3) contributo alla comprensione del ruolo dei radicali liberi nei tumori
L’ESR per divenire una tecnica ospedaliera necessita solo di un confronto accurato con i metodi diagnostici tradizionali e di uno sforzo per giungere alla realizzazione di uno spettrometro di ESR versatile ed automatico da utilizzare in ambiente ospedaliero.
